Mateen tiba di kelab malam "Pulse" pada 12 Juni 2016 bersenjatakan pistol dan senapan otomatis. Kala Mateen memuntahkan peluru, pengunjung kelab tersebut masih mengira suara itu berasal dari beat musik yang sedang mereka dengarkan. Baru sembilan menit kemudian, muncul pernyataan resmi dari "Pulse" lewat akun Facebooknya, "Semua, lekas keluar dari Pulse dan lari sejauh mungkin!"

Beberapa orang terjebak di dalam kelab langsung dijadikan sandera oleh pelaku. Dalam aksi penyanderaan itu, Mateen menghabisi nyawa 50 orang dan melukai 53 orang lainnya. Penyanderaan yang berlangsung pada pukul 02.00 waktu setempat, berakhir tiga jam kemudian.

Polisi berhasil memasuki "Pulse" dan menembak mati pelaku. Tiga puluh sandera berhasil dibebaskan usai penyerbuan itu. Di dalam kelab, 39 orang ditemukan tewas, dua lainnya ditemukan tak bernyawa di luar kelab. Sepuluh korban lainnya tewas dalam perjalanan menuju rumah sakit.

Omar Mateen memiliki nama lengkap Omar Mir Seddique Mateen. Ia lahir pada 16 November 1986 di New York dari orang tua berdarah Afghanistan. Pada 2013 dan 2014, ia pernah masuk daftar selidik Federal Bureau of Investigation (FBI) terkait afiliasinya dengan Moner Mohammad Abu Salha, seorang muslim radikal Amerika. Namun pada tahun ini, ia sudah tak lagi dalam pengawasan FBI.

Pada saat penyerangan, selain menyebutkan nama ISIS, Mateen juga menyebut nama kakak-beradik pelaku teror Bom Boston kepada polisi. Ia menyatakan serangan yang ia lakukan serupa dengan apa yang dilakukan Tamerlan dan Dzokhar Tsarnaev di Boston Marathon.